يبدأ الموسم الرابع من Knockout Town في 7 ديسمبر: قيادة الأجسام الطائرة المجهولة، والمشاجرة عبر موقع تحطم الكائنات الفضائية موقع PlayStation

من ناحية أخرى، قد يكون سجل C57BL/6 new casino payments الممتاز شائعًا لأنه على الأرجح أكثر مرشحات التهجين الداخلي شيوعًا في المختبرات، كما أن أكثر من 1000 جهاز إطار عمل CRISPR تستخدم C57BL/6 كجينوم بحثي. يوفر أحدث اتحاد تسلسل جينوم الفأر (MGSC) اقتراحاتٍ دقيقةً لتسلسل الجينوم لبناء الحمض النووي للمتبرع. يجب فحص منطقة أي إدخال موجه بعناية فائقة لضمان عدم تداخله مع أي عناصر تنظيمية. حتى بعد استخدام CRISPR، يصعب إنتاج إدخالات أكبر من 5 كيلو بايت في الفئران.

على سبيل المثال، لإنتاج أليل ناقض مشروط جيد، يعمل حمض نووي واحد طويل من SS متبرع، يحتوي على إكسون/إكسونات مفلطحة، بشكل أكثر فعالية من استخدام زوج من sgRNAs لإدخال مواقع loxP في وقت واحد. ولكن على عكس المتطلبات الفعلية للزيجوت الفأري، سيتم التحقق من صحة sgRNAs في مزرعة الأنسجة عندما لا يتوفر تحليل الكيسة الأريمية للفئران المانحة (Went et al., 2013a). يمكن استخدام أنسجة العينة، مثل Wang et al., 2013؛ Yang et al., 2013) لتحديد أداء تحرير الجينوم قبل الحقن، حيث توفر عضلة Es أفضل كفاءة HDR من الخلايا الجسدية (Yu et al., 2015).

اعتبارات الوقت

بالإضافة إلى كفاءة sgRNA، هناك قلق آخر بشأن تعديل الجينوم، وهو احتمال حدوث طفرات خارج نطاق العنوان، خاصةً عند محاولة التعرف على النمط الظاهري للفأر. يوفر برنامج CRIPSR sgRNA ملخصًا للمواقع المحتملة خارج نطاق الهدف، لذلك، كلما أمكن، يمكن اتباع نهج ممتاز قائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للمساعدة في تحديد أي طفرات إندِل في هذه المواقع باستخدام اختبار عدم تطابق الإنزيم. سيتم استخدام التهجين مع فأر بري "نظيف" لعزل أي طفرات غير مرغوب فيها (وإن أمكن، سيتم إجراء بعض التهجينات على الأقل لتقليل الطفرات خارج نطاق الهدف) (Raveux et al., 2017).

الخطوة الثانية: إنشاء وبناء ركيزة خطية بسبب تفاعل البوليميراز المتسلسل

قد يكون تعديل معايير الإباضة الفائقة وجمع الزيجوت ضروريًا، ولكن ليس ضروريًا، مع التحديات الإضافية (Qin et al., 2016). يمكن إجراء تكوين sgRNA وmRNA Cas9 على الزيجوت الفأري إما عن طريق الحقن السيتوبلازمي، عادةً باستخدام مُعالج دقيق قائم على أساس بيزو، أو عن طريق الحقن النووي، عادةً باستخدام مُحقن دقيق (Yang et al., 2014). بشكل عام، لم يُلاحظ وجود اختلافات ظاهرية تُشير أحيانًا إلى نوع الولادة (Horii et al., 2014).

لإجراء تعديلات جينية في الخلايا الثديية، تُزيل هذه الحذفات جينًا سليمًا نتيجةً لطفرة في تغيير الهيكل. من ناحية أخرى، إذا أمكن الحصول على الحمض النووي للمتبرع، فسيتم تثبيت أحدث DSB مع HDR، حتى لو كان حجمه أقل من NHEJ. تم تعديل CRISPR-Cas9 لاحقًا للتلاعب الوراثي بالكامل في الحيوانات، مثل إنتاج خلل في الجينات وحذفها في الفئران.

يمكن استخدام إعادة التركيب لإجراء عمليات الحذف، والطفرات الجزئية، والتضاعف، والانعكاسات، والاندماجات، والعلامات. تُضاف ركيزة خطية من الحمض النووي (DNA) تحتوي على التغيير أو التماثلات اللازمة إلى الحمض النووي المُوجَّه إلى النسيج. لا يُعدّ Gam ضروريًا لإعادة التركيب، ولكنه يزيد من سرعة إعادة تركيب الحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA) حتى 20 انحناءً. يُعدّ Exo إنزيمًا خارجيًا مُثبّتًا للحمض النووي ثنائي السلسلة (5'→3') وهو ضروري لإعادة تركيب الحمض النووي ثنائي السلسلة. يُعدّ البروتين بيتا الأساسي الجديد، وهو بروتين أساسي لتليين الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)، الإنزيم الرئيسي لإعادة التركيب في إعادة التركيب. والأهم من ذلك، أن خدمات إعادة التركيب المضيفة، بما في ذلك بروتينات إعادة التركيب السرية RecA، ليست ضرورية لإعادة التركيب.

بناءً على الترتيب بعيدًا عن موقع loxP، تُؤدي عملية إعادة التركيب الجديدة إلى حذف أو عكس الجينات المستهدفة. نظرًا لطبيعة cre-loxP القابلة للتحريض، سيتم تحريض أحدث عملية إخراج جين بواسطة السموم، بما في ذلك التتراسيكلين والتاموكسيفان. يعمل التتراسيكلين على تنشيط نسخ cre recombinase الجديد، بينما يتولى التاموكسيفان مسؤولية النقل النووي. تهدف البادئات الجانبية إلى إنشاء نقطة تمركز غير متماثلة للجينات المُضافة في وحدة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد ذلك، يُشق أي عدم تطابق بواسطة مادة كيميائية T7E1 (WT – النمط البري؛ HT – متغاير الزيجوت) لإنشاء بعض الأجزاء المُختزلة في مصل الأجاروز.

بينما يُغيّر آل أوليفاريس منطقة صدرهم للدخول في القتال الداخلي الجديد على يمين كاستيلو، ستكون ضربة كاستيلو العلوية بمثابة إطار لمنع أوليفاريس من استخدام الخطاف السفلي. مع وضعية الجسم في الوضع المناسب، يُوجّه كاستيلو لكمة علوية حماسية ليُتيح له مساحة كافية للخروج من القتال الداخلي، مُعيدًا ضبط نفسه إلى مسافة مناسبة. مع ذلك، عندما لم يتمكن أوليفاريس من الدخول في القتال الداخلي للحصول على أعلى مستوى له، انخفضت قدرته على التلاعب بوصلته المتبقية بشكل كبير.

وقد ثبت أن عمليات الحذف الكثيرة والإدخالات الجينومية الكبيرة ممكنة باستخدام تقنية كريسبر (تشانغ وآخرون، ٢٠١٥). كما يُعدّ الحقن من توائم sgRNAs مثاليًا لتحسين فرص استهداف الجين الجديد، خاصةً عند الحاجة إلى تعديل الجينات ثنائية الأليلات (تشو وآخرون، ٢٠١٤). وُصفت الطفرات غير المستهدفة عمومًا بأنها تُعدّل جينوم كريسبر في خلايا سرطان الثدي لدى الأفراد، ولكنها قد تصبح غير طبيعية في الزيجوت لدى الفأر (فو وآخرون، ٢٠١٣؛ يانغ وآخرون، ٢٠١٣). ومع ذلك، لا تزال الطفرات غير المستهدفة تُشكّل مصدر قلق عند دراسة الفئران المُعدّلة وراثيًا. يُساهم قطع واحد من Cas9n في حدوث شق في خيط واحد فقط يُمكن إصلاحه بسهولة؛ وبالتالي، لإنشاء DSB حقيقي، يلزم وجود عدد قليل من sgRNAs. لقد أحدثت تقنية CRISPR-Cas9 تغييراً كبيراً في تركيز الجينات داخل أنسجة الفئران كطريقة لتحرير الجينوم، وذلك نتيجة للإطار البسيط والوقت الأسرع المطلوب لإنتاج الفئران المخترعة.

• في الوقت الذي يتفوق فيه فريق دوران على فريق بالومينو، الفريق المتصدر في نفس الوقت، لم يتمكن بالومينو من رمي الكرة الصحيحة ليمنحه التقدم.
• لقد فقد موقع EcoRI المتحمس في الواقع على دراية بإدخال الحمض النووي للمتبرع لاستيعاب النمط الجيني لفأر knockin المصنوع بواسطة CRISPR حيث لم يتم قطع حلقة KI PCR من Lso.
• على الرغم من أن عمليات الإدراج أو الحذف الأعلى قد لا تحتاج إلى عدد قليل من sgRNAs لإكمال المدة على طول الحمض النووي الجينومي ليتم استبداله أو إزالته.
• تُفضل تصميمات الفئران الشرطية لفحص مشكلة الشخص عندما يُظهر الآخر تشابهًا في النمط الظاهري عند حذف جينات معينة.
• تم إنشاء إدخالات بحجم دوس كيلوبايت واحد فقط باستخدام CRISPR، ومع ذلك فإن نتائج HDR تتضاءل بشكل أساسي لأن قياسات حجم الإدخال الجديد تتوسع إلى ما هو أبعد من مدتها.

بالإضافة إلى قدرة إنزيم نوكلياز الحمض النووي على Cas9، أُعيد استخدام CRISPR لإضافة وظيفة موجهة بالحمض النووي الريبي (RNA) لتنظيم النشاط النسخي الجديد من جينات العائلة المستهدفة. يتحقق ذلك باستخدام Cas9 مُعطّل (dCas9) مُرتبط بمنشطات النسخ، ومثبطات النسخ، ومعدلات التخلق الجيني (Komor et al. 2017). كبديل، يتم تنشيط الجينات المستهدفة باستخدام Cas9 من النوع المجنون أيضًا باستخدام sgRNAs غير نشطة مُعدّلة مُصممة باستخدام أبتامرات MS2 ذات دبوس الشعر. يتم اختصار هذه الأنواع من sgRNAs الميتة لمنع تكوين DSB لأن أبتامرات MS2 تُسجل بروتينًا أساسيًا مُختلطًا يتكون من بروتين غلاف البكتيريا MS2 الأساسي المرتبط بمنشط نسخي جيد (Liao et al. 2017). لقد ثبت أن أسلوب تنشيط الجينات فعال في الفئران، وبالتالي يمكن دفع التعبير المستهدف بعيدًا عن الجينات المعروفة بقدرتها على المساعدة في تحسين الأمراض مثل جميع أشكال مرض السكري، وفشل الكلى، واعتلال العضلات.

تُسرّع هذه الجينات المُركّزة، بالإضافة إلى التطوير النهائي لتقنية CRISPR-Cas9، من وقت نموّ الفئران المُعدّلة وراثيًا من 8 إلى 10 أسابيع إلى 90 يومًا. وقد حلّت تقنية CRISPR-Cas9 محلّ ZFNs وTALENs من حيث سهولة التركيب والتصميم (الشكل 1). تتطلّب ZFNs وTALENs تجميعًا من نطاقات ربط الحمض النووي متعدد الوحدات لكلّ عنوان جينومي جديد. تعتمد CRISPR على تكوين مُركّب ريبونوكليوبروتين عالي الجودة من إنزيم Cas9 للحمض النووي، وهو RNA "دليلي" يُوجّه إلى أن يتمّ إنشاء DSB جينومي عالي الجودة على 20 bp من التسلسل التكميلي المُطابق.